工作原理：

儀器通過熒光染料或熒光標記探針，實時追蹤每一輪PCR循環(huán)后的核酸擴增產物總量，將熒光信號變化轉化為可量化數(shù)據(jù)；通過繪制標準曲線，結合循環(huán)閾值（Ct值）精準計算出未知樣本的初始模板DNA濃度，實現(xiàn)“邊擴增、邊檢測”，無需后續(xù)開蓋電泳處理，全程閉管操作避免交叉污染。

操作步驟速查表：

開機前5項必查：

確認儀器散熱口無遮擋，環(huán)境溫度穩(wěn)定在‌20~30℃‌

準備無酶無熱源光學級耗材，禁止使用普通PCR管

所有試劑提前冰上解凍，全程佩戴無粉手套操作

確認熱蓋硅墊清潔無破損，加熱塊適配當前耗材規(guī)格

提前完成核酸樣本質控，OD260/280值在‌1.8~2.0‌區(qū)間

體系配制核對清單：

按「預混液→引物→無酶水→最后加模板」順序加樣，降低交叉污染

20μl常規(guī)體系各組分體積誤差控制在±0.2μl以內

加樣后輕彈管壁混勻，瞬時離心1分鐘清除管底氣泡

所有樣本、NTC陰性對照、陽性對照均設置3個技術復孔

染料法實驗提前確認SYBR Green對應FAM通道，避免選錯熒光通道

上機運行關鍵校驗：

布板信息與實際孔位100%對應，無錯配漏標

熱循環(huán)程序參數(shù)核對：預變性95℃ 2min → 40個循環(huán)（95℃15s→55~65℃30s→72℃30s）

染料法必須增設65~95℃熔解曲線程序，升溫速率0.1℃/s

反應板平穩(wěn)放入樣品槽，確認貼合加熱塊后再關閉熱蓋

運行全程禁止打開儀器蓋，避免溫度波動影響擴增效率